Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2021 |
| Druh | Technicky realizované výsledky (prototyp, funkční vzorek) |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Popis | V rámci dosavadního průběhu projektu se podařilo výpočetně navrhnout novou sadu syntetických koelenterazin-závislých luciferáz, označených jako AncFT9 až AncFT16. Za tímto účelem byl použit nově vytvořený algoritmus, který je postupně implementován do nového softwarového nástroje LoopGrafter, a který je momentálně vyvíjen a testován v Loschmidtových laboratořích. Výpočetní návrh byl proveden na proteinovém templátu termostabilního domnělého předka luciferázy RLuc z Renily fialové (Renilla reniformis). Tento domnělý předek byl navržen v naší laboratoři (Chaloupkova et al., 2019). Výpočetním algoritmem implementovaným v programu LoopGrafter jsme nyní do tohoto předka transplantovali různé kombinace proteinových smyček lemujících aktivní místo enzymu, které jsme v našich předešlých experimentech objevili jako klíčové pro zesílení luciferázové funkce v tomto proteinovém foldu (Schenkmayerova et al., 2021). Tímto postupem vznikla nová sada syntetických luciferáz (AncFT9 až AncFT16). Geny kódující navržené luciferázy byly výpočetně optimalizovány pro rekombinantní produkci v Escherichia coli, a následně byla provedena jejich syntéza a klonování do expresního plasmidu pET21b. Na 3´-konec genů byla vložena sekvence kódující hexahistidinovou kotvu pro usnadnění afinitní purifikace rekombinantních enzymů. Geny byly vloženy pod kontrolu indukovatelného promotoru T7. Expresní testy v malém měřítku ukázaly, že všechny nově zkonstruované syntetické luciferázy se produkují jako solubilní proteiny v E. coli. Z expresních testů je evidentní (Obrázek 1), že rozpustnost nově designovaných luciferáz je výrazně vyšší než rozpustnost stabilizované luciferázy z Renily fialové (RLuc8). Vysoká expresibilita a rozpustnost rekombinantních luciferáz jsou klíčové parametry pro jejich aplikační využití jako reportérové bioluminiscenční enzymy. Tři nově zkonstruované luciferázy (AncFT9, AncFT15 a AncFT16) byly vybrány pro detailní biochemickou charakterizaci. Rekombinantní produkce těchto luciferáz ve velkém měřítku ukázala, že je možné získat až desítky miligramů těchto luciferáz z 1 L buněčné kultury E. coli (Obrázek 2). Teplotní stability produkovaných luciferáz byly měřeny pomocí diferenciální skenovací fluorimetrie a jsou uvedeny v grafické příloze (Obrázek 3). Měření koelenterazin-závislé luciferázové aktivity prokázala, že nově zkonstruované luciferázy jsou plně funkční, generují modré světlo, a jejich enzymatická aktivita je prokazatelně vyšší než aktivita předešle zkonstruovaného prototypu AncFT (Tabulka 1). |
| Související projekty: |