Development of electrophoretically mediated microanalysis method for the kinetics study of flavin-containing monooxygenase in a partially filled capillary
| Název česky | Vývoj elektrokineticky zprostředkované mikroanalytické metody pro kinetickou studii flavin obsahující monooxygenasy v částečně plněné kapiláře |
|---|---|
| Autoři | |
| Rok publikování | 2008 |
| Druh | Článek v odborném periodiku |
| Časopis / Zdroj | Electrophoresis |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Biochemie |
| Klíčová slova | Clozapine EMMA flavin containing monooxygenase kinetics |
| Popis | byla vyvinuta metoda elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy s využitím částečného plnění kapiláry pro flavin obsahující monooxygenasu, forma 3 (FMO3). In-line enzymatická reakce byla provedena ve 100 mM fosfátovém pufru (pH 7,4) zatímco 150 mM fosfátový pufr (pH 3,3) byl použit jako základní elektrolyt. Dlouhá zóna kofaktoru NADPH rozpuštěného v rekčním pufru, byla nadávkována hydrodynamicky do křemenné kapiláry a následována zónou enzymu a substrátu. Reakce byla iniciována v teplotně kontrolované částikapiláry při 37C aplikací napětí 9kV po 0,9 min. Napětí bylo vypnuto, aby vzrostlo množství produktu (tzv. zero potential amplification) a následně opět zapnuto konstatní napětí 10 kV pro separaci všech látek, které byly detekovány při vlnové délce 191 nm. Vyvinutá metoda elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy byla aplikována na kinetiskou studii FMO3 s využití clozapinu jako substrátu. Konstanta Michaeli-Mentenové hodnoty 410,3 uM byla vypočtena z korigovaných ploch píku produktu clozapinu N-oxidu. Hodnota maximální rychlosti (Vmax.) byla vypočtena 1,86 nmol/nmol enzymu/min. Kinetické parametry FMO3 jsou ve shodě s publikovanými daty. |
| Související projekty: |